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麦麻素4-MAIMASU™应用于美白去斑之相关研究产品说明书

专利成份

 Studies of 4-MAIMASU™ as a New Skin Hypopigmenting Agent

序论

色素淡化剂的药物，被用于皮肤医学的治疗和药用化妆品中，已有很长一段时间，在酪氨酸酶上的抑制有著大量的研究。

有许多方法用来去除不正常的色素斑点，可使用色素淡化剂或称美白淡斑剂，如下图的对苯二酚，麴酸，熊果素，传明酸，维他命C类，胜肽类，生化或植物萃取液及相关的色素淡化剂等，或者以物理性的方法，如雷射治疗，磨皮手术等，来治疗不正常的皮肤黑色素沉著[1~4]。

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第二章 美白淡斑的机转

2-1 皮肤中黑色素的形成与分布

皮肤色素的研究已有20多年的历史；自1980年以来，黑色素(Melanin)生合成路径已由皮肤癌研究者研究[5]，也造就了美白化妆品和药物治疗的发展。表皮内黑色素异常增加的疾病，如黑斑或雀斑等色素异常症，其发病原因与紫外线、女性荷尔蒙以及遗传因素等有关，但详细的机制仍未明了。而以黑色素为对象的美白剂(Whitening Agents)便成为我们所采用的一种症状疗法。从皮肤黑色素形成与代谢的机制来看，美白用药剂的作用机转包括：抑制黑色素细胞内黑色素的形成、还原体内旧有的黑色素、促进表皮内黑色素的代谢以及对黑色素细胞的毒杀[6]。

在哺乳类动物中，显见的色素形成(pigmentation)起因于黑色素在皮肤与头发毛球(hair blubs)中的合成与分布(图1)[7]，黑色素在吸收所产生的自由基也扮演决定性的角色，在细胞质内和在防护细胞从各种类型的离子射线，包括UV。黑色素有两种基础型态：eumelanins是褐色或黑色，而pheomelanins是红褐或黄色；两种混合的类型被发现于哺乳类动物中，令人感兴趣的是，pheomelanin有能力促使自由基对UV反应，而自由基会加重细胞损伤，pheomelanin有可能给予增强被UV诱发的皮肤损伤，而不是保护皮肤[8]。

图1 哺乳动物的皮肤草图指出表皮层(epidermis)、真皮层(dermis)和皮下组织(sub-cutaneous layer)三个主要层，显见的色素形成产生于皮肤真皮层中的黑色素细胞里，黑色素的合成与分布。

了解色素沉著路径的基本资讯，有助于讨论各种皮肤明亮剂(skin-lightening)

与它们已知的活性机制。经由黑色素细胞，黑色素被合成的类型和数量，与它围

绕于角质细胞的分布形态，决定了皮肤实际的颜色。黑色素形成是透过一系列的

 氧化反应，包括氨基酸－酪氨酸在酪氨酸酶酵素的存在下[9]。第一步骤是最关键性的，因为剩余的反应顺序，在一生理的pH值下能自发性地被继续进行 (Halaban et al., 2002)。于此，酪氨酸酶转换酪氨酸形成dihydroxyphenylalanine (DOPA)，接著形成dopaquinone，而透过自发性的氧化作用，dopaquinone被转换成dopachrome，最后形成dihydroxyindole或dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA)，变成Eumelanine(咖啡色-黑色)。后续的反应发生在dopachrome tautomerase和DHICA oxidase的存在下。在cysteine或glutathione的存在下，dopaquinone被转换成cysteinyl DOPA或glutathione DOPA，随后形成黄色-红色色素pheomelanin(图2)。

图2 黑色素生合成(melanogenesis)路径

2-2 黑色素生成的调节作用

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在哺乳类动物中，色素形成的调节作用，于许多不同的程度被控制，并在每个程度范围完全复合。最原始的黑色素细胞于神经脊(neural crest)中形成，并在胚胎发展的期间迁移，当最后黑色素细胞不均匀分布在皮肤中时，于精确的基因控制下，迁移作用的形式会导致一些有趣的条纹花样，如所见的斑马和长颈鹿[10]。色素形成也被调节在细胞层次下，经由黑色素细胞合成黑色素在黑色素体里面。最后，黑色素生合成(melanogenesis)被调节在细胞的次结构(subcellular)层次，在这里合成和各种黑色素生成酵素的表现，而抑制剂扮演一关键的角色[11,12]。在表皮中，黑色素细胞与邻近的细胞作用，紧密的融合。它们经由各种生物学因子，包括介白素(interleukins)、干扰素类(interferons)、生长因子类、维它命类和前列线素类(prostaglandins)而被影响，不是只有一个因子决定黑色素被合成。但究竟是那种黑色素类型被产生，据推测，这些因子提供了复合信号，如刺激色素在伤口生成、UV的曝露或其它环境的刺激，在某种程度上诱发改变色素的产生[13]。一般已知黑色素生成的刺激物是黑色素细胞-刺激荷尔蒙(MSH或melanotropin)，经由晚期的脑垂体一胜肽被产生。一旦MSH键结到黑色素细胞表面受体，显见的结果是，往上增加100倍的黑色素生合成[14]。

2-3 不同人种中色素形成的差异

皮肤颜色功能的大小、数量、与黑色素体的分布，而不是黑色素细胞的密度，事实上，黑色素细胞的数量在所有人种中都是一样的。然而，黑人的黑色素细胞形成的皮肤色素较厚、较长、被分支成树状突。Briganti等人[15]和Jablonski、Chaplin[16]提及，人种皮肤中色素形成的差异是靠黑色素产生的数量与关于黑色素体分布于表皮的区域与沉淀，现在，少数已知相关于任何步骤，调节人种的色素生成相对的重要性。

酪氨酸酶是黑色素合成的速率限制步骤之酵素，缺乏此酵素的活性将导致人类产生白化症(albinism)[17]。看来似乎很可能从各种皮肤类型在人类皮肤颜色的人种差异，或许首先起初由于差异在酪氨酸酶活性。由黑人皮肤所产生的黑色素细胞比从白人皮肤多十倍活性[18]，然而，来自黑人皮肤的黑色素细胞中，较高程度的酪氨酸酶活性不是因为大量的酪氨酸酶，存在于白人皮肤黑色素细胞中酪氨酸酶分子的数量，被发现相等于在色素最深的黑人皮肤类型[19]。

 Rana等人发现，在黑人皮肤中，黑色素固著在角质层，且经由自然脱皮而脱离，而在白人的皮肤中，色素被降解在颗粒层，这很可能是被白人皮肤中所拥有的酵素处理掉，这指出白人皮肤的角质层不含有任何黑色素。在许多国家，非洲，加勒比，北、中美洲，化庄品使用美白产品被考虑施用在暗沉肤色的女性中，许多成分容易被用在没有处方籤的消费者，这可能与滥用有关[20]。

2-4 现今的研究

人口老化以及光老化，使恶性的色素形成变得更加常见，且渐增的消费者需

要来处理这美容的问题。色素沉著由其它因素，如黑斑与发炎反应后的的情况，也让病人渐增注意了解到，显示能被改善与治疗[8,21]。正在改变的人口与在非高加索人口的增长，也产生增加在色素的疾病，促使消费者以天然的来源作护肤

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与治疗的产品兴致，现已迫使加速搜寻在新的皮肤去色素剂[22]，尽管对苯二酚的单一疗法与其它处方的强度，在部份被公认是有效的，但它们有缺点，包括高价、可能对皮肤有刺激性以及需要被限制持续使用。因此更多适当地产品含有效但低刺激成分，如麴酸、甘草萃取物和大豆将持续被发展。将来在决定化妆品化合物，依据色素形成路径的不同步骤而作用应有帮助，如副作用被减少和临床结果被改善。有许多的待筛选的化合物能作为去色素剂，但需要更严密地监控临床试验，来评估它们的安全性与有效性。

2-5 美白去斑剂

(1) 麦麻素™ (4-MAIMASU™)

由专利成份4-MAIMASU™化学结构来看，与对苯二酚的结构相似，，而在Chu等人(2007)[23]所发表的研究指出，4-MAIMASU™在抑制蘑菇酪氨酸酶(mushroom tyrosinase)方面，对酪氨酸酶显示剂量依存抑制性(如表1所示)。蘑菇酪氨酸酶在不同浓度的4-MAIMASU™中的抑制作用被显示于表1。当4-MAIMASU™的浓度增加，酵素活性迅速地被减少。而比较其它不同的酪氨酸酶抑制剂，其结果显示，所有的化合物在10到400 mM的浓度对于酵素活性显示剂量依存抑制作用。4-MAIMASU™的抑制浓度(IC50)，意指能降低50%的活性浓度为350.64 mM，而对苯二酚，熊果素，麴酸分别是91.6, 329.16, 388.1 mM。(IC50：半数抑制浓度，即某物质抑制的效果达到50%的浓度)

表1) 4-MAIMASU™、对苯二酚(HQ)、熊果素和麴酸对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用

 4-MAIMASU™的抑制作用在黑色素生成上的影响，透过测定黑色素合成以及在B16细胞中与4-MAIMASU™处理后的酪氨酸酶活性被研究。如图3所示，底部丸状的颜色是B16细胞是以不同剂量的4-MAIMASU™被处理三天，接著以相位差显微镜拍摄(图4)。以4-MAIMASU™被处理的细胞，很明显地看到黑色素较少。以不同浓度的4-MAIMASU™处理三天，有显著地抑制在老鼠黑色素细胞中的酪氨酸酶活性与黑色素的形成，而且在增加4-MAIMASU™的浓度后细胞中黑色素的含量也跟著减少。

4-MAIMASU™       4-MAIMASU™        4-MAIMASU™

0.05 mM (0.0006%)     0.1 mM (0.0012%)      0.5 mM (0.0062%)

图4) 显微镜下观察B16黑色素瘤细胞，以不同剂量4-MAIMASU™处理 三天后的数量

            

图5) 比较对苯二酚、麴酸、熊果素与4-MAIMASU™在不同浓度下抑制黑色素生成的效果。

图6) 比较对苯二酚、麴酸、熊果素与4-MAIMASU™在不同浓度下细胞的酪氨酸酶抑制作用。

图7) 比较对苯二酚、麴酸、熊果素与4-MAIMASU™在不同浓度下的细胞存活率。

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1：对照组；                        2：对苯二酚0.05 mM (0.0006%)；

3：熊果素0.2 mM (0.0054%)；       4：麴酸0.2 mM (0.0028%)；

5： 4-MAIMASU™ 0.1 mM (0.0012%)； 6：4-MAIMASU™ 0.5 mM (0.0062%)；

7：4-MAIMASU™ 1 mM (0.0124%)

4-MAIMASU™的去斑效果可能被认为，应归因于酪氨酸酶的抑制或是由于细胞毒性使黑色素细胞数量减少。而后述的可能性经由在不同浓度的4-MAIMASU™所培养的细胞数量被排除，如图7所示，当浓度低于1.0 mM时并没有显著的减少细胞存活率被观察到。由此实验可知，4-MAIMASU™比对苯二酚更加安全与温和，不像对苯二酚是以毒杀黑色素细胞来达到美白效果。

为了评估4-MAIMASU™在老鼠黑色素细胞中对黑色素生成的抑制效果，并比较对苯二酚、4-MAIMASU™、熊果素和麴酸在黑色素的形成和酪氨酸酶活性的抑制作用。在这些实验中，对苯二酚和4-MAIMASU™，在黑色素的含量显示出比熊果素和麴酸有著较强的抑制效果。当B16细胞以1.0 mM的4-MAIMASU™被处理三天，在与控制组的比较下，黑色素的产生被减少到只剩45%。然而，在低于0.1 mM的浓度，4-MAIMASU™显示轻微的黑色素含量抑制作用，此浓度相同于熊果素和麴酸。以4-MAIMASU™处理后，酪氨酸酶活性与未处理的细胞比较，被减少到只剩30.96%，在1.0 mM的4-MAIMASU™下，其抑制效果比其它美白剂好，而且不影响细胞生长。相反的，对苯二酚却被可观察到对黑色素细胞有毒杀性。使用4-MAIMASU™对酪氨酸酶信使RNA的表现程度没有被影响。4-MAIMASU™能抑制黑色素合成可被归因于，它是抑制细胞的酪氨酸酶活性。在这些实验中，证明了4-MAIMASU™在老鼠黑色素细胞中，于非细胞毒性浓度下黑色素合成的抑制效果。以1.0 mM的4-MAIMASU™与细胞被处理并和未处理的细胞比较，黑色素合成被减少到只剩45%。在0.5 mM的4HBA下，与对照组比较，B16黑色素细胞的细胞酪氨酸酶活性被减少到只剩下32.3%。由以上实验的结果可得结论是，这些低毒性与黑色素合成的高抑制作用等实验，都再三指出，4-MAIMASU™能被使用在美容产品中做为快而不反弹的皮肤美白去斑剂。